Tag: sds-page

Tugas Mandiri Karya Tulis Ilmiah PLP 2019

ABSTRAK

Langkah preparasi sampel merupakan suatu tahapan penting yang harus diperhatikan sebelum memulai kegiatan analisis. Langkah ini dapat bervariasi pada sampel tergantung pada matriks sampel tersebut dan kondisi saat preparasi. Preparasi sampel protein/enzim yang bersifat sensitif cahaya dan Oksigen-sensitif seperti pada enzim Nitrogenase harus dilakukan pada kondisi anaerob. Sampel harus dihindarkan dari paparan Oksigen. Untuk menjaga agar kondisi sampel saat preparasi, digunakan teknik penyiraman (flushing) dengan nitrogen cair secara berulang pada sampel selain penambahan 1mM DTT pada buffer ekstraksi. Dengan teknik preparasi ini diperoleh hasil analisis SDS-PAGE sampel enzim target Nitrogenase pada bintil akar tanaman muncul pada sekitar berat molekul Nitrogenase 43 kDa. Penyiraman (flushing) berulang dengan nitrogen cair ini dapat dikembangkan sebagai teknik isolasi sampel protein/enzim yang bersifat Oksigen-sensitif.    

Keyword : nitrogenase, enzim, isolasi, preparasi, sampel, protein, Bradford, SDS PAGE, elektroforesis, nitrogen, bintil akar, tanaman, fisiologi, tumbuhan 

PENDAHULUAN

Analisis sampel protein/enzim sering dilakukan di Unit Fasilitas Penelitian Bersama (FALITMA) Fakultas Biologi UGM. Sampel protein yang dianalisis merupakan produk hasil fermentasi, biosintesis dan biomolekul hasil metabolit sekunder maupun primer dalam sampel biologis. Sampel protein/enzim ini cenderung rentan mengalami perubahan sifat terhadap kondisi lingkungan diluar sampel seperti suhu, pH dan cahaya, juga terhadap matriks sampel itu sendiri. Pada langkah persiapan sampel dan isolasi, beberapa sampel protein/enzim memerlukan perlakuan khusus agar kandungan analit dalam sampel dapat dianalisis. Perlakuan pada matriks ekstraselular untuk mengurangi komponen yang dapat merusak sampel protein/enzim, diantaranya; penambahan proteinase inhibitor cocktail untuk mencegah protease pada matriks merusak protein pada proses isolasi (Loddick, 2013), penambahan polimer hidrofobik PVP10 untuk penyerapan matriks senyawa fenolik dan ROS yang dapat menyebabkan degradasi protein (Yao, 2006), dan penambahan EDTA/EGTA sebagai pengkhelat logam Mg²⁺ dan mencegah kontaminasi metalloprotein (Ritchie, 2012).

Ekstrasi enzim Nitrogenase yang berasal dari tanaman mempunyai kerumitan tersendiri karena enzim Nitrogenase ini bersifat sensitif terhadap cahaya dan juga Oksigen-sensitif, sangat mudah rusak jika terpapar oleh Oksigen. Ekstraksi enzim Nitrogenase harus dilakukan pada kondisi anaerob, temperatur terjaga, juga minim pencahayaan.

Untuk menjaga enzim Nitrogenase agar tetap baik hingga saat dianalisis, maka, pada teknik preparasi enzim dilakukan secara anaerob dengan penambahan Ditiothreitol (DTT) sebanyak 1 mM dan Sodium Dithionite (Na₂S₂O₄) sebanyak 2 mM pada langkah preparasi. Penambahan ini bertujuan untuk mempertahankan suasana anaerob saat ekstraksi, dengan DTT bertindak sebagai deprotecting atau agen pereduksi dari gugus Sulfhidril yang mampu mengoksidasi protein sehingga menyebabkan hilangnya aktifitas (Klonne, 1998), sedangkan Sodium Dithionite adalah garam anorganik yang mampu mereduksi senyawa oksidatif (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Sodium_dithionite).

Karena ketiadaan bahan pereduksi Sodium Dithionite, maka, kami menggunakan bahan pengganti yang mempunyai sifat mampu mempertahankan suasana anaerob pada sampel. Kami mengamati pada laboratorium Mikrobiologi UGM menggunakan gas Nitrogen non-fluid untuk inkubasi bakteri anaerob. Sehingga, liquid Nitrogen kami pilih sebagai bahan alternatif selama pelaksanaan ekstraksi. Nitrogen cair ini merupakan bahan yang mudah didapatkan di Fakultas Biologi UGM karena kami mempunyai tangki cryo untuk menyimpan sel dan bakteri dalam nitrogen cair. Teknik preparasi yang kami terapkan adalah perlakuan penyiraman (flushing) secara berulang pada sampel sebanyak 3 kali; sesaat setelah pemecahan sampel, saat penggerusan, dan saat pemindahan sampel yang telah dihaluskan kedalam mikrotube. Dengan teknik tersebut sampel yang bersifat sensitive-Oksigen seperti enzim Nitrogenase dapat kami analisis dengan SDS-PAGE tanpa kehilangan pita enzim target pada 43 kDa.

METODE

Pengujian ini dilakukan di unit Fasilitas Penelitian Bersama (FALITMA), Fakultas Biologi UGM. Sampel yang telah diambil dari lapangan disimpan dalam standing pouch aluminium atau dibungkus alumunium foil. Penyimpanan sampel dan preparasi untuk analisis enzim Nitrogenase dilakukan pada -20°C.

Alat dan Bahan. Alat yang kami gunakan pada percobaan ini adalah seperangkat SDS-PAGE (BioRad), pH-meter (Metrohm), sentrifuge dingin (Hettich), ELISA reader (BioTek), timbangan analitik semi mikro (AND), lumpang dan pestle, serta bahan habis pakai seperti mikrotube, pipet tip, konikal, dan sebagainya. Adapun bahan yang kami gunakan adalah nitrogen cair, basa Tris (Merck), Titriplex III (Merck), SDS (Roche), DTT (Roche), protein standar 2 mg/ml (Roche), akrilamid 30% (BioRad), reagen Bradford (Sigma Aldrich), APS (Amresco), 2x sample buffer (Santa Cruz), ẞ-mercaptoethanol (Merck), TEMED (Amresco), dan isopropanol (Merck).    

Preparasi Sampel. Sebanyak 0,5 gram sampel bintil akar kedelai ditimbang, disiram dengan nitrogen cair (flushing) dan dibiarkan hingga setengah lunak, sampel kemudian dihancurkan menggunakan lumpang dan pestle. Di tengah proses penggerusan, sampel disiram kembali dengan nitrogen cair untuk membantu penghancuran sampel menjadi seperti serbuk. Setelah itu sampel dipindahkan ke mikrotube, sebelum ditutup sampel disiram kembali dengan nitrogen cair dan ditunggu hingga nitrogen cair habis barulah ditutup.   

Ekstraksi Mitokondrial. Kedalam sampel ditambahkan buffer ekstraksi (Tris-Cl 50 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, SDS 2,5%, dan DTT 1 mM). Kemudian campuran disentrifuge pada kecepatan 14.000 xg selama 10 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang terbentuk dikumpulkan kedalam mikrotube baru dan disimpan pada suhu -20°C sebagai lysat protein.

Analisis Kadar Protein Terlarut Total. Sebanyak 8 µl lysat protein ditambahkan 200 µl reagen Bradford yang sudah disuhu-ruangkan. Kompleks biru yang terbentuk dibaca densitas optiknya OD₅₉₅ pada ELISA reader dengan panjang gelombang 595 nm. Kuantitas protein ditentukan melalui persamaan kurva dari pengukuran deret Protein standar 2 mg/ml.

Analisis SDS-PAGE (Laemmli). Dibuat resolving gel 12% dengan mencampurkan 3,45 ml dH₂O, 2,5 ml 4x buffer Tris-Cl pH 8,8, 4,0 ml Akrilamid 30%, 50 µl APS 10%, dan 5 µl TEMED (sesaat sebelum dituang). Larutan resolving kemudian dituangkan pada cetakan spacer dan glass plate hingga tersisa sepertiga dari cetakan. Sebelum larutan resolving memadat, ditambahkan isopropanol untuk meratakan permukaan resolving gel, setelah gel memadat, isopropanol dihilangkan dengan kertas saring. Dibuat stacking gel 4% dengan mencampurkan 3,05 ml dH₂O, 1,25 ml 4x buffer Tris-Cl pH 6,8, 0,67 ml Akrilamid 30%, 25 µl APS 10%, dan 5 µl TEMED (sesaat sebelum dituang). Larutan stacking kemudian dituangkan pada cetakan hingga memenuhi sisa ruang pada cetakan dan dipasangkan sisiran pada bagian atas cetakan. Sampel lysat protein dipersiapkan dengan penambahan 2x sampel buffer 2:1 dan 1 µl ẞ-mercaptoethanol, denaturasi dilakukan pada suhu 60°C selama 3 menit. Elektroforesis dilakukan selama 1 jam pada 50 voltase hingga mencapai resolving gel dan dilanjutkan kembali dengan voltase 100 volt selama 1 jam.    

HASIL DAN PEMBAHASAN

Teknik preparasi sampel pada protein/enzim memerlukan perlakuan khusus agar target protein/enzim pada sampel tidak mengalami kerusakan. Preparasi ini melibatkan pemilihan buffer dengan pH yang sesuai, penambahan aditif yang menjaga sampel protein/enzim dari kerusakan, dan perlakuan kimia maupun fisika untuk membantu proses isolasi protein/enzim target. Pemilihan strategi preparasi yang tepat sangat tergantung pada matriks dan sifat sampel tersebut.     

Enzim Nitrogenase adalah suatu enzim yang berfungsi mengkatalisis pembentukan Ammonia (https://proteopedia.org/wiki/index.php/Nitrogenase). Nitrogenase memerlukan perlindungan dari Oksigen dan bersifat sangat Oksigen-sensitif. Sebagai katalis, Nitrogenase terbentuk melalui jalur perakitan multigen dan aktivasi fungsinya. Mitokondria adalah tempat terjadinya fotosintesis, pada matriks mitokondria ini terdapat enzim pengubah Oksigen yang membuat enzim-enzim yang bersifat Oksigen-sensitif mampu berfungsi. Matriks mitokondrial adalah lokasi yang sesuai untuk pembentukan dan aktivitas Nitrogenase (Curatti dan Rubio, 2014).

Sampel dengan sifat yang rentan dan matriks yang komplek seperti pada analisis enzim Nitrogenase ini, memerlukan langkah preparasi yang sesuai agar protein/enzim dapat dipertahankan keaktifannya hingga tahap proses analisis sehingga data yang diperoleh merupakan data yang sebenarnya/valid. Sebagian besar protein/enzim merupakan zat yang rentan suhu dan pH, preparasi dan analisisnya sebaiknya dilakukan pada suhu dingin (4°C) dan pH buffer yang dipertahankan. Untuk menghindari paparan Oksigen, enzim Nitrogenase perlu dipreparasi secara anaerobic.

Cara mempertahankan kondisi sampel agar bersifat anaerob adalah dengan menambahkan 1 mM DTT dan 2 mM Sodium Dithionite (Lundquist & Huss-Danell,1991). DTT dan Sodium Dithionite akan bertindak sebagai protector agent yang melindungi sampel dari paparan Oksigen radikal maupun Oksigen bebas pada lingkungan sampel, dengan mekanisme penghambatan/reduksi senyawa Oksigen. Di laboratorium kami sudah ada bahan DTT, namun kami belum bisa mendapatkan bahan Sodium Dithionite. Untuk itu, kami mencoba melakukan penggantian bahan dan mencari alternatif pengkondisian anaerob pada sampel. Kebetulan di laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi UGM menggunakan gas Nitrogen sebagai pengkondisi anaerob. Sehingga kami menggunakan Nitrogen cair untuk membuat kondisi anaerob pada sampel dengan kontak paparan Nitrogen yang lebih lama (hingga masuk ke mikrotube).

Hasil yang kami peroleh setelah sampel dianalisis dengan SDS-PAGE adalah sebagai berikut :

Dari gambar 1 diatas dapat diamati dengan cukup jelas dan masih terlihat pita pada lokasi enzim target yaitu pada 43 kDa. Hasil ini sudah sesuai dengan metode analisis dari jurnal yang kami jadikan acuan.

KESIMPULAN

Dari hasil pengujian kami, dapat kami simpulkan sebagai berikut :

1. Penggantian bahan Sodium Dithionite dengan Nitrogen cair dapat dilakukan, hanya teknik pengaplikasiannya harus dilakukan berulang; saat sampel hendak digerus, di tengah penggerusan sampel, dan saat sampel dipindahkan kedalam mikrotube.
2. Nitrogen cair mampu mempertahankan kondisi sampel bersifat anaerob sehingga enzim Nitrogenase masih dapat diamati.

DAFTAR PUSTAKA

Loddick, Sarah A., Ross, Sarah J., Thomason, Andrew G., Robinson, David M., Walker, Graeme E., Dunkley, Tom PJ., Brave, Sandra R., Broadblent, Nicola, Stratton,  Natalie C., Trueman, Dawn, Mouchet, Elizabeth, Shaheen, Fadhel S., Jacobs, Vivien N., Cumberbatch, Marie, Wilson, Joanne, Jones, Rhys D.O., Bradbury, Robert H., Rabow Alfred, Gaughan, Luke, Womack, Chris, Barry, Simon T., Robson, Craig N., Critchlow, Susan E., Wedge, Stephen R., and Brooks, Nigel A. 2013. AZD3514: A Small Mollecule that Modulates Androgen Receptor Signaling and Function in Vitro and in Vivo. Mol Cancer Ther. 12(9): 1715-1727.

Yao, Yuan, Yang, Yi-Wei, Lu, Jin-Yuan. An Efficient Protein Preparation for Proteomic Analysis of Developing Cotton Fibers by 2-DE. 2006. Wiley Electrophoresis Journal. 27 : 4559-4569.