Skip to main content

Polymerase Chain Reaction dan Pemotongan DNA Menggunakan Enzim Restriksi (PCR-RFLP)

Alifah Workshop

Praktikum Diklat Laboran bidang Human dan Biomedik 2018

Praktikum PCR-RFLP ini merupakan aplikasi teknik PCR untuk melihat bakat penyakit kanker darah pada pasien. DNA pada darah pasien diisolasi kemudian diperbanyak dengan amplifikasi PCR. DNA tersebut kemudian di digest menggunakan enzim restriksi Msp1 yang memecah urutan CC GG dan GG CC sehingga akan terbentuk 2 band pada pasien yang positif/mempunyai bakat kanker darah (terdapat band tambahan pada 165,42 bp).

  1. Isolasi DNA dari sampel darah

Siapkan tube steril 1,5 ml dan tuliskan nama sampel

Set mikropipet dan tip steril

Kit Ekstraksi DNA “Favorgen”

Step 1. Lisis sel darah merah

  • Pindahkan 300 ul sel darah dalam tube 1,5 ml + 900 ul RBC lysis buffer (3 x sampel vol.)
  • Inkubasi 10 menit di suhu ruang (dibolak-balik)
  • Sentrifugasi 10.000 rpm selama 5 menit, buang supernatant
  • Resuspensi pellet dengan 100 ul RBC lysis buffer

Step 2. Lisis sel darah putih

  • Tambahkan buffer FABG 200 ul, di-vortex mixing –>FABG memecah sel darah putih shg DNA dan RNA nya keluar
  • Inkubasi 10 menit di suhu ruang (dibolak-balik)
  • Lakukan pipetting jika terjadi presipitat

Step 3. Pengikatan

  • Tambahkan 200 ul Ethanol absolut dingin, vortex 10 detik
  • Masukkan kolom FABG kedalam collection tube, pindahkan sampel ke kolom FABG
  • Sentrifugasi 10.000 rpm selama 5 menit, buang collection tube
  • Ganti collection tube dengan yang baru

Step 4. Pencucian

  • Cuci kolom FABG dengan 400 ul buffer W1
  • Sentrifugasi 10.000 rpm selama 30 detik, buang supernatant
  • Pasangkan kembali collection tube ke kolom FABG
  • Cuci kolom FABG dengan 600 ul buffer W1
  • Sentrifugasi 10.000 rpm selama 30 detik, buang supernatant
  • Pasangkan kembali collection tube ke kolom FABG
  • Sentrifugasi 10.000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan kolom

Step 5. Elusi DNA

  • Pindahkan kolom FABG ke tube 1,5 ml steril (baru)
  • Tambahkan 50-100 ul buffer elusi hangat, biarkan selama 5 menit
  • Sentrifugasi 10.000 rpm selama 30 detik
  • DNA yang terkumpul dalam tube 1,5 ml disimpan pada suhu -20 C

2. Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Nanodrop

3. Polymerase Chain Reaction

4 dan 5. Elektroforesis Hasil PCR dan pengamatan hasil elfo menggunakan UV-transiluminator

6 dan 7. PCR-RFLP (Restriksi enzim Msp1) dan elektroforesis hasilnya