Pengujian Aktivitas Enzim Superoksida Dismutase (SOD) dengan Metode Autooksidasi Pyrogallol

Instrumen yang digunakan :

Spektrofotometer UV-Vis Scanning (Thermo Sci. – GenesysUV10), pH-meter ketelitian 0,001 (Metrohm)

• 

• 

Enzim Superoksida Dismutase (SOD) berperan dalam meregulasi aktifitas senyawa prooksida dalam sel dengan mengkatalisis perubahan anion superoksida menjadi oksigen dan peroksida. Pada tanaman, diidentifikasi tiga jenis SOD (Cu/ZnSOD, FeSOD, dan MnSOD) tergantung dari kofaktor logam yang aktif pada situs (Sytykiewicz, 2014). Isoform Cu/ZnSOD ditemukan pada sitosol, kloroplas, mitokondria, peroksisom dan diluar sel, isoenzim FeSOD juga ditemukan pada kloroplas, dan MnSOD terlokalisasi di mitokondria (Lee YP, 2010).

Dalam kondisi normal tanaman, perubahan ini paling banyak terjadi pada mitokondria, dimana SOD mitokondrial (MnSOD) sebagai system enzim antioksidan endogen yang menjaga level normal spesi oksigen reaktif (ROS) yang terbentuk pada siklus respirasi. Prinsip dismutasi spesi oksigen reaktif oleh metalloenzim SOD adalah karena sifat molekular oksigen bebas yang mempunyai dua elektron yang tidak berpasangan dan perputaran parallel, maka molekul oksigen bebas lebih memilih reduksi univalen karena terbatasnya putaran saat direduksi dengan pasangan elektron. SOD mampu dengan cepat mendismutasi reduksi univalen Oksigen O₂.^– (Marklund, 1974). Sehingga SOD merupakan jalur utama pertahanan oksidasi.

Sifat SOD yang mampu mendismutasi spesi oksigen ini yang digunakan oleh Marklund & Marklund, 1974 dalam menentukan kandungan enzim SOD memanfaatkan reaksi penghambatan autooksidasi pyrogallol oleh enzim SOD. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 325 nm dimana terjadi penyerapan maksimum oleh pyrogallol. Pengukuran serapan pada panjang gelombang maksimumnya memberikan hasil yang lebih baik sensitifitasnya dengan limit deteksi metode mencapai 1.17 U/mL atau setara dengan 3,0×10^-10 mol/L. Metode ini merupakan pengembangan terbaru dari metode Marklund.

Reaksi penghambatan autooksidasi pyrogallol sangat bergantung pada pH larutan, pH ideal dijaga agar berkisar 7,9 dimana 99% autooksidasi pyrogallol dihambat oleh SOD (Marklund, 1974).

Bahan yang harus disiapkan :

• Pyrogallol (ditimbang 25 mg dalam 10 ml ddH2O)
• Buffer Fosfat atau PBS 50 mM pH 7,4
• Buffer pereduksi dari Tris-Cl 50 mM pH 8,2 dan buffer EDTA 1 mM pH 8,0
• Nitrogen cair untuk preparasi sampel

Uji tambahan : pengujian protein (optional) untuk mengetahui jumlah protein total (mg protein) yang ditambahkan kedalam reaksi.

Preparasi sampel :

• Ditimbang sebanyak 0,5 gram, digerus dengan penambahan nitrogen cair.
• Dipindahkan ke mikrotube 1,5 mĺ dan ditambahkan 1-1,5 ml buffer fosfat atau PBS.
• Sentrifugasi sampel 10.000 rpm selama 15 menit (suhu 4°C)
• Supernatan hasil sentrifugasi dipindahkan ke tube baru untuk uji protein total dan SOD.
• Selama handling sampel diletakan di dalam ice box (4°C)

Uji kuantitas protein total (optional) :

• Diambil sebanyak 8 ul supernatan dimasukkan ke dalam sumuran microplate, tandai sesuai plot sampel.
• Dibuat deret Standar Protein dengan memipet 1 ul, 2 ul, 3 ul, 4 ul, 5 ul, 6 ul, 7 ul dan 8 ul ke dalam sumuran dan ditambahkan dH2O sehingga volume total 8 ul dan diperoleh konsentrasi 0,25, 0,50, 0,75; 1,0; 1,25; 1,50; 1,75; dan 2 mg/ml.
• ke dalam sumuran sampel dan standar ditambahkan reagen bradford masing-masing sebanyak 200 ul dan dihomogenkan.
• Absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 595 nm dengan alat Mikroplate/ELISA reader.
• Hasil pembacaan absorbansi sampel diplotkan pada kurva standar untuk perhitungan konsentrasi.

Uji kuantitas protein ini dapat dilakukan jika dikehendaki jumlah protein yang direaksikan diketahui, tapi jika tidak pun tidak berpengaruh terhadap hasil. Karena aktivitas enzimatis tidak dipengaruhi oleh jumlah protein/enzim yang ditambahkan kedalam reaksi. Hasil pengukuran aktivitas SOD nya bisa sama antara penambahan 0,1 ml sampel dan 0,01 ml.

• 

• 

Batas pengukuran alat adalah 3,000 absorban, sehingga jumlah protein yang disarankan berkisar 40-60 mg (aktivitas yang terlalu besar menyebabkan perubahan autooksidasi pyrogallol sukar diamati). Prinsip pengujian ini adalah penghambatan autooksidasi pyrogallol sehingga absorbansi sampel akan lebih kecil dari blank. Jika didapati hasil uji negatif (absorbansi sampel lebih besar dari absorbansi blank), artinya oksidasi pyrogallol tidak teramati. Pengujian bisa dicoba ulang dengan menambah jumlah pyrogallolnya pada sampel dan blank. Atau kemungkinan pada sampel sudah tidak terdapat enzim SOD (habis atau rusak), alternatifnya bisa diukur enzim POD/CAT atau H2O2 level karena produk perubahan SOD adalah H2O2.

Uji SOD dengan Spektrofotometer UV-Vis :

• Disiapkan buffer pereduksi dan larutan pyrogallol, beserta supernatan sampel.
• Setting alat dipilih pada mode “Kinetik” untuk mendapatkan data Absorbansi pada rentang waktu (delta A).
• Waktu pembacaan diatur 3-5 menit interval 1 menit
• Sampel diukur satu – persatu direaksikan :
• Asample :

1 ml buffer Tris-EDTA
0,008 ml sampel ~ 8 ul
0,010 ml Pyrogallol ~ 10 ul
–‐———— +
1,018 ml total larutannya

• Ablank (pyrogallol) :

1 ml buffer Tris-EDTA
0,008 ml aquadest ~ 8 ul
0,010 ml Pyrogallol ~ 10 ul
–‐———— +
1,018 ml total larutan

• Blank Spektro (dipasang di B untuk mengenolkan nilai matrix – selain pyrogallol)

1 ml buffer Tris-EDTA
0,008 ml aquadest ~ 8 ul
–‐———— +
1,008 ml total larutannya

Perhitungan kadar SOD (unit/ml)
SOD = ((((dAb-dAs)/dAb) ×100%)/50%) × 1,018 × (1/8)

Referensi :

Marklund & Marklund, Involvement of The Superoxide Anion Radical in the Autooxidation of Pyrogallol and a Covenient Assay for Superoxide Dismutase, Eur. J. Biochem. 47 (1974)

Nathania et al., Bartolli et al., 1999; Selote dan Khana-Chopra, 2004; Farooq et al., 2008